主持人: 孟孟孝
博士: 美國密西根州立大學微生物學系
碩士: 台灣大學農業化學系
學士: 台灣大學農業化學系
博士後研究: 美國德州大學西南醫學中心(達拉斯)生化暨分子生物學系
中興大學研究發展處學術發展組 組長 (2001-2004)
中興大學生物科技學研究所 所長 (2008-2014)
中興大學生物科技學士學位學程 主任 (2008-2014)
國科會93年度 傑出研究獎
碩士: 台灣大學農業化學系
學士: 台灣大學農業化學系
博士後研究: 美國德州大學西南醫學中心(達拉斯)生化暨分子生物學系
中興大學研究發展處學術發展組 組長 (2001-2004)
中興大學生物科技學研究所 所長 (2008-2014)
中興大學生物科技學士學位學程 主任 (2008-2014)
國科會93年度 傑出研究獎
研究興趣:
在分子層次闡明蛋白質分子(特別是酵素)的作用機制是本研究室的主要研究興趣。 期待從結構與動力學的角度去理解特定蛋白質分子具有特定功能的基礎原因,也期待從蛋白質分子間的互動關係去釐清更為複雜的生物程序。從應用的角度,我們利用蛋白質工程的技藝去改良酵素的應用性,與利用微生物代謝工程的策略創造具特定工業價值的微生物菌株。進行中的研究課題摘要說明如下。
竹嵌紋病毒複製蛋白質的功能闡析
竹嵌紋病毒(Bamboo mosaic virus 簡稱BaMV) 為正股RNA病毒,基因體由約6400 鹼基組成,擁有5個轉譯架構 (ORF),另有5端帽結構 (5’ cap0) 與3端聚腺苷酸尾(3’-polyA tail),其中ORF1 負責生成病毒之複製蛋白質(含1366 個胺基酸殘基)。由於竹嵌紋病毒研究團隊多年來對此病毒分子生物學的探討研究,竹嵌紋病毒已成為馬鈴薯病毒屬(Potexvirus genus)的代表性成員,享譽國際植物病毒學界。在研究團隊的分工中,本實驗室首先針對竹嵌紋病毒複製蛋白質進行系統性的生化分析工作。研究成果闡釋此蛋白質具有三個功能性區段,分別為N端的mRNA 戴帽酵素區(capping enzyme domain)、中間區的三磷酸酶區(RNA5’-triphosphatase domain)、與C端的RNA複製酶區(RNA-dependent RNA polymerase domain、簡稱RdRp),並闡述了病毒合成5’-cap0 結構的獨特機制。研究所得的知識不只適用於同屬之其他病毒成員,對廣大的阿爾發病毒超科(Alphavirus superfamily)成員也具有參考價值。以帽結構形成的機制為例,過程簡述如下: (1) 戴帽酵素辨識結合GTP與AdoMet,(2)酵素之GTP methyltransferase活性催化甲基由AdoMet轉移至GTP之N7原子上,形成m7GTP,(3) 酵素之m7GTP:RNA guanylyltransferase活性接力作用,由活性中心之組胺酸(His68)殘基發動親核性反應,攻擊m7GTP之內側磷酸根,進而形成[m7GMP-His68-Enzyme]共價鍵中間複合體,並釋出焦磷酸根,(4)5’-雙磷酸RNA進入活化位,啟發親核性反應,攻擊複合體之磷酸官能基,在RNA之5’產生cap0結構。
近年來,本實驗室利用酵母雙雜交法與蛋白質體學的策略(附圖)尋覓與病毒複製蛋白質具有交互作用的植物寄主因子。蛋白質體學的策略著重在病毒複製酶複合體的優化與分離,再以串聯質譜儀鑑定出與病毒複製酶具有交互作用的植物宿主蛋白質。確定目標蛋白質因子後,利用基因靜默的技術調降該因子在菸草中的表達量,或在菸草原生質體中增量該因子的表現量,以分析該因子對竹嵌紋病毒繁衍能力的影響。已完成功能分析的宿主蛋白質因子有NbPMTS1與XRN4。NbPMTS1為轉甲基酶,對病毒的複製具有抑制能力。XRN4為核酸5’→3’外切酶,推測能去除不正常的核酸複製產物,提升病毒核酸的複製效率。目前仍有多個宿主蛋白質因子在進行功能分析中。上述研究能使我們知曉病毒如何利用或挾持特定的宿主蛋白質(或生理程序)進行病毒的複製,也有望找到一些能拮抗病毒繁衍的蛋白質,深化我們對植物先天免疫機制的理解。
近年來,本實驗室利用酵母雙雜交法與蛋白質體學的策略(附圖)尋覓與病毒複製蛋白質具有交互作用的植物寄主因子。蛋白質體學的策略著重在病毒複製酶複合體的優化與分離,再以串聯質譜儀鑑定出與病毒複製酶具有交互作用的植物宿主蛋白質。確定目標蛋白質因子後,利用基因靜默的技術調降該因子在菸草中的表達量,或在菸草原生質體中增量該因子的表現量,以分析該因子對竹嵌紋病毒繁衍能力的影響。已完成功能分析的宿主蛋白質因子有NbPMTS1與XRN4。NbPMTS1為轉甲基酶,對病毒的複製具有抑制能力。XRN4為核酸5’→3’外切酶,推測能去除不正常的核酸複製產物,提升病毒核酸的複製效率。目前仍有多個宿主蛋白質因子在進行功能分析中。上述研究能使我們知曉病毒如何利用或挾持特定的宿主蛋白質(或生理程序)進行病毒的複製,也有望找到一些能拮抗病毒繁衍的蛋白質,深化我們對植物先天免疫機制的理解。
褐色嗜熱裂孢菌在生質能源生產上的開發應用
褐色嗜熱裂孢菌(Thermobifida fusca)為格蘭氏陽性菌株,具有菌絲,屬於放線菌門。常用的褐色嗜熱裂孢菌株T. fusca YX的基因體已經在2007完成基因解序及功能註解工作。根據所公布的基因體訊息,它擁有9個纖維質分解相關酵素(包括Endocellulase、Exocellulase、Cellobiosidase、與-Glucosidase)與5個以上的半纖維素分解相關酵素(包括Xylanase、Mannanase、與L-arabinofuranosidase等)。但是它並不具有類似真菌的木質素分解相關酵素(如漆酶 [Laccase]、木質素過氧化氫酶[Lignin peroxidase]、與鎂依賴型過氧化氫酶等)。由於褐色嗜熱裂孢菌可充分降解甘蔗渣,因此猜測它可能會分泌促進木質素降解的酵素。近來來我們發現編碼1114的基因負責生成一個含銅之酚類氧化酶(簡稱Tfu1114),生化分析證實Tfu1114具有類似漆酶的活性。但是此酵素與漆酶有諸多不同處:(1)胺基酸序列組成迥異,且Tfu1114的分子量約為一般漆酶的一半大;(2)單位蛋白質分子所含銅離子的數目不同;(3) 疊氮化鈉是漆酶的強力抑制劑,但對Tfu1114無效;(4)漆酶的氧化過程氧氣會被還原成水分子,但是在Tfu1114的氧化反應中氧氣會被還原成過氧化氫分子。另外,實驗證實經Tfu1114氧化處理的甘蔗渣會釋出雙木質醇分子,顯示甘蔗渣中之木質素有被降解的跡象。綜觀以上證據,我們認為Tfu1114是一個新穎的木質素降解酶。令人感興趣的是Tfu1114能顯著增加糖化酵素群對甘蔗渣的分解能力,增加還原醣的釋出量。由於木質素的破壞效率是木質纖維素使用於生產生質能源或纖維化學品的關鍵因素,Tfu1114的應用潛力值得進一步探討。
更長遠的目標是希望能夠以褐色嗜熱裂孢菌作為基改的對象,進行代謝路徑的調整與修改(代謝工程)。期待基改後的菌株能夠以農產纖維廢棄物為原料,經菌株代謝作用轉換成有用的化學分子建構物(Building blocks)。這方面的工作首先要建立有效率的菌株轉形程序(Transformation protocol)與可資利用的分生工具(例如基因載體)。為此,我們進行能感染褐色嗜熱裂孢菌的嗜菌體的分離與基因開發工作,希望從中得到有利上述工作的材料與知識。
更長遠的目標是希望能夠以褐色嗜熱裂孢菌作為基改的對象,進行代謝路徑的調整與修改(代謝工程)。期待基改後的菌株能夠以農產纖維廢棄物為原料,經菌株代謝作用轉換成有用的化學分子建構物(Building blocks)。這方面的工作首先要建立有效率的菌株轉形程序(Transformation protocol)與可資利用的分生工具(例如基因載體)。為此,我們進行能感染褐色嗜熱裂孢菌的嗜菌體的分離與基因開發工作,希望從中得到有利上述工作的材料與知識。
馬紅球菌在固醇藥物生產上的開發應用
馬紅球菌USA-18菌株(Rhodococcus equi USA-18)能在含固醇的培養基中充分代謝固醇,快速生長。在固醇的代謝路徑中3-酮類固醇-9α-羥基化酵素為開環反應的重要酵素,缺乏此酵素活性將使得固醇的多環結構無法裂解。近來,實驗室利用基因同源重組的原理剔除此酵素中的還原酶單元基因,使得剔除突變株無法產生具有活性的3-酮類固醇-9α-羥基化酵素。此突變株能在發酵液中累積3-oxo-23,24-bisnorchola-1,4-dien-22-oic acid 和 1,4-androstadiene-3,17-dione (ADD)兩種固醇藥物工業中多種固醇藥合成的重要中間藥物。實驗室持續開發分子遺傳工具,以利對馬紅球菌USA-18菌株進行遺傳工程改質,改變或新增固醇代謝路徑,生產具醫藥價值的固醇代謝物。